Verzet tegen Karel V en Philips II
Het verzet tegen de centralisatiepolitiek van Karel V krijgt rond 1520 een nieuwe dimensie als rondreizende marskramers vanuit Duitsland nieuwe godsdienstige ideeën meebrengen. De leer van Maarten Luther vindt in het begin vooral gehoor onder de monniken van het klooster Mariënborn. De nieuwe ideeën winnen snel aanhang en de rooms-katholieke overheid, waaronder hertog Karel van Gelre, reageert met nieuwe strenge wetten: de plakkaten.
Na de troonsbestijging van Philips II in 1555 verscherpt de situatie zich. De politieke en godsdienstige tegenstellingen worden versterkt door economische teruggang en de slachtoffers die de pest maakt. In Arnhem stierven in 1565 elke dag zo’n zes tot zeven inwoners.
Na de Beeldenstorm van 1566, die aan Arnhem voorbijgaat, komt de Spaanse generaal Alva een jaar later naar de Nederlanden om orde op zaken te stellen. De zoon van Alva, Don Frederik, regeert in Arnhem met harde hand: de aanhangers van de nieuwe godsdienstige leer, in de ogen van de katholieke kerk zijn het ketters, worden in de Rijn verdronken. Drie ketters worden op de Grote Markt levend verbrand.
Als in 1574 weer de pest uitbreekt in Arnhem en de belastingen door de Spaanse bestuurders worden verhoogd, neemt het verzet weer toe.
Arnhemse Beeldenstormen, 1578-1579
Het stadsbestuur dient de bevelen en plakkaten van Philips II en diens bewindvoerders op te volgen. Dat verandert in 1578 als Johan van Nassau, de broer van de leider van de opstand Willem van Oranje, stadhouder van Gelre wordt. Met Arnhem als residentie voert de protestantse stadhouder de nieuwe leer in en vervangt de zittende magistraat.
Hij staat toe dat vanaf 1578 hervormde kerkdiensten op de Markt worden gehouden. Predikant bij deze diensten is een vroegere veldprediker van de troepen van graaf Johan Casimir: Johannes Fontanus. De preken van deze volgeling van de hervormer Johannes Calvijn vinden steeds meer toehoorders, want Fontanus preekt in het Nederduits. Onder diens leiding, en met steun van stadhouder Johan van Nassau, wordt de nieuwe leer in Arnhem gevestigd.
De balans slaat door naar de andere kant. De gereformeerden bestormen de Broerenkerk van het Minderbroedersklooster om deze op te eisen voor de nieuwe leer. Zo krijgt Arnhem toch zijn beeldenstorm, want er sneuvelen vele beelden en schilderingen worden beschadigd bij deze bezetting.
Een jaar later, in 1579, als Johannes Fontanus in de Grote of St. Eusebiuskerk een uitvaartdienst houdt, voelen de rooms-katholieken zich zo bedreigd dat ze naar de wapens grijpen. Daarop wordt de kerk door soldaten bezet en moet de katholieken het veld ruimen. Zo is rond 1580 Arnhem geheel overgegaan op de nieuwe leer en moeten de rooms-katholieken vluchten (bijv. naar Huissen, want onder het Duitse Kleef viel) of in het geheim hun geloof uitoefenen.
Strijd
Door de gevechten is het buiten de stad gevaarlijk.
Dat ondervindt in 1586 bijvoorbeeld de Engelse officier Philip Sidney die dient in het Engelse leger dat onder leiding van zijn oom, de graaf van Leicester, staat. Bij de mislukte belegering van Zutphen raakt Sidney zwaargewond en overlijdt enkele weken later in Arnhem aan zijn verwondingen.
In 1591 vindt er ten zuiden van Arnhem nog een veldslag plaats tussen de opstandelingen o.l.v. Prins Maurits van Oranje en het Spaanse leger van de hertog van Parma.
Vestingstad in de Opstand
Rond 1600 verplaatst de strijd zich steeds meer naar het zuiden en nemen de directe oorlogsgevolgen voor de stad af. Arnhem profiteert ook van de rust van het Twaalfjarig Bestand (1609-1621). Als na deze wapenstilstand de oorlog wordt hervat laat Maurits tussen 1629-1623 de vestingwerken rond de stad verstevigen en uitbreiden onder leiding van de vestigbouwer Simon Stevin.
De “Vrede van Münster” in 1648 maakt een definitief einde aan de oorlog. Gelre en Arnhem hebben, als onderdeel van de Republiek der Verenigde Nederlanden, het Habsburgs-Spaanse bestuur van zich afgeschud.
De vrijheid van godsdienst is zeer betrekkelijk. De hervormde/gereformeerde godsdienst maakt de dienst uit in Arnhem. Tot 1795 mogen katholieken niet in openheid hun godsdienst uitoefenen.